当非糖尿病病人及其他各方面看来都很健康的人出现焦虑、醉酒样行为或前述的大脑功能受损症状时，应测定血糖和胰岛素水平。血糖水平在50mg/dl以上时极少出现低血糖症状。偶尔，一些人血糖尚在较高水平即可出现症状，而另一些人血糖下降很低方出现症状。有血糖降低及相应的临床表现者可确定诊断。食糖后数分钟内血糖上升，症状缓解，则支持低血糖症的诊断。

检测病人血糖可以在医务室内进行，也能在家中检测，在症状出现时，刺破手指，采集一滴血，用血糖仪监控血糖水平。但家庭血糖监控仅仅推荐为糖尿病患者使用。口服葡萄糖耐量试验，常用来诊断糖尿病，而很少用来诊断低血糖症，因其结果易产生误导作用。

低血糖症几乎都能找到病因。根据病人用药的历史、体格检查及简单的实验室检测结果一般是能够明确低血糖病因的。然而少数病人则需住院进行更多的实验室检查，如怀疑自身免疫性低血糖症，则需检测血中胰岛素抗体。

饥饿期间（有时达72小时）测定血中胰岛素水平可确定病人是否患有胰岛素瘤。手术前肿瘤应该定位。然而虽然计算机断层摄影（CT）、磁共振成像或超声波扫描能发现肿瘤，但一般肿瘤很小，以至于用上述检查不能发现，常需手术探查来证实胰岛素瘤的存在。